Charakterisierung der Interaktion zwischen HBV/HDV und dem spezifischen Rezeptor NTCP durch die Identifizierung von Protein-Protein Interaktionen und Interaktionsdomänen

Das Na+/Taurocholate Cotransporting Polypeptide (NTCP, Gensymbol: SLC10A1) stellt das erste und am besten charakterisierte Mitglied der SLC10 Proteinfamilie dar, zu der aktuell sieben Transmembranproteine zählen. Neben der physiologischen Funktion als exklusiv in der Leber exprimierter Gallensäuretransporter, erfüllt das NTCP zusätzlich eine Funktion als hochspezifischer Rezeptor für das Hepatitis B (HBV) und Hepatitis D (HDV) Virus. Beide Viren sind durch eine identische Virushülle gekennzeichnet und werden daher mittels Endozytose nach NTCP-Bindung in Leberzellen aufgenommen.
Für die SLC10 Proteinfamilie konnte als gemeinsames Charakteristikum gefunden werden, Homo-, sowie Heterodimere mit anderen Mitgliedern derselben Proteinfamilie zu bilden, was vor allem durch das Membrane Yeast-Two Hybrid (MYTH) System in Hefezellen untersucht und partiell durch die Co-Immunpräzipitation (Co-IP) in humanen HEK293-Zellen bestätigt wurde. Eine Proteinsequenzanalyse der SLC10 Proteine ergab sowohl ein konserviertes GXXXG Motiv in der siebten, als auch ein partiell konserviertes GXXXG/A Motiv in der zweiten Transmembrandomäne. Diese Motive sind bereits seit der Entdeckung im humanen Glycophorin A im Jahre 1992 als Dimerisierungsmotive in einer Vielzahl von dimerisierenden Proteinen bekannt. Durch Mutation dieser Motive im NTCP konnte im MYTH-System eine Reduktion der Dimerisierung beobachtet werden, was jedoch nicht durch eine Co-IP bestätigt werden konnte. Co-Lokalisationsversuche mit dem Wildtyp-NTCP, sowie Transportexperimente mit Taurocholat bestätigten eine Loss-of-function-Mutation im Falle der Mutante G233XXXG237, sowie ein dem Wildtyp ähnliches Verhalten für die Mutante G60XXXA64. Zusätzlich zeigte sich im Vergleich zum Wildtyp-NTCP eine signifikant niedrigere HBV-Infektionsrate in Zellen, die mit der Mutante G60XXXA64 transfiziert wurden. Da die Dimerisierung des NTCP als essentieller Faktor für eine erfolgreiche Endozytose des HBV angesehen wird, ist es möglich, dass die Mutante G60XXXA64 aufgrund einer niedrigeren NTCP-Dimerisierungsfähigkeit die HBV-Infektion hemmt. Allerdings deuten die Daten auch darauf hin, dass die untersuchten GXXXG/A Motive für eine korrekte Faltung und das Sorting in die Plasmamembran vom NTCP wichtig sind.
Im Rahmen eines MYTH-System-Screenings, mit dem Ziel, Proteininteraktionspartner des NTCP aus einer cDNA-Bibliothek aus der humanen Niere zu identifizieren, konnte als häufigster Treffer das IFITM3 gefunden werden. Dieses spielt für die angeborene Immunität eine große Rolle und ist als viraler Restriktionsfaktor bekannt. In den beiden humanen Leberzelllinien HepG2 und HuH7 konnte die Interaktion zwischen IFITM3 und NTCP mittels Co-IP bestätigt werden. Durch siRNA-vermittelte Knockdown-Experimente konnte mit hoher Effizienz die Expression des IFITM3 gehemmt werden, um die Auswirkungen auf dem NTCP zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass in den HepG2-Zellen eine verminderte IFITM3-Expression gleichzeitig eine erniedrigte NTCP-Expression auf Gen- und Proteinebene nach sich zog, sowie eine verminderte Transportrate von Taurocholat. IFITM3 könnte also als NTCP-stabilisierender Faktor fungieren. In HuH7-Zellen und primären humanen Hepatozyten konnte zudem gezeigt werden, dass IFITM3 die Infektion mit HBV/HDV zu unterstützen scheint. Zumindest war die Infektion nach Knockdown von IFITM3 deutlich gehemmt. Aufgrund der Tatsache, dass sich die Bindung des myr-PreS1-Peptids unter Knockdown des IFITM3 quantitativ nicht von der Kontrolle signifikant unterschied, scheint sich die Interaktion zwischen IFITM3 und HBV/HDV erst nach der Bindung am NTCP abzuspielen. Aufgrund der physiologischen Lokalisation des IFITM3 in der Membran von Endolysosomen ist es denkbar, dass HBV/HDV und IFITM3 innerhalb der Endosomen nach der Endozytose derart interagieren, dass es zu einer stärkeren Infektion kommt, allerdings sind weitere Untersuchungen nötig, um den exakten Mechanismus aufzudecken, welcher dieser Beobachtung zu Grunde liegt. Auf Grundlage der ermittelten Daten scheint es möglich durch Blockade von IFITM3, z.B. durch Rapamycin oder Amphotericin B, die HBV-/ HDV-Infektion von Leberzellen zu begrenzen, die Folge wäre jedoch das Aufsteigen anderer viraler Infektionen, die physiologischerweise durch IFITM3 gehemmt werden.