Plasmonenbasierte Zelltransfektion im Hochdurchsatz mittels ultrakurzer Laserpulse

Ein wichtiger Bereich der Molekularmedizin ist die genetische Veränderung von Zellen
durch Transfektion. Hier bieten Primär- und Stammzellen großes Potential, um
gentherapeutische Ansätze zu entwickeln. Ferner kann das Einschleusen von Nukleinsäuren
wie siRNA im Hochdurchsatz zur Identifizierung der Funktion von Zielgenen
und damit zur Wirkstofffindung dienen. Etablierte Methoden, wie Elektroporation oder
virale Transduktion, sind für diese Transfektionsanwendungen nicht immer geeignet.
Hier bietet die fs-Optoinjektion die bisher beste Alternative der laserbasierten Verfahren.
Jedoch handelt es sich um eine Einzelzelltransfektion mit geringem Durchsatz.
Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung einer plasmonenbasierten Transfektionsmethode
im Hochdurchsatz mit hoher Effizienz bei geringer Toxizität. Ebenfalls sollte
die Methode selektiv und zelltypunabhängig sein. Um Nukleinsäuren in Zellen einzuschleusen,
muss die Zellmembran für diese permeabilisiert werden. Die Interaktion
von ultrakurzen Laserpulsen mit membranlokalisierten Goldnanopartikeln führt zur
lokalen, transienten Membranperforation. Durch das Abrastern der Zellen mit einem
schwach fokussierten Laserstrahl wird so ein hoher Durchsatz erreicht.
Mit einem fs-Laser wurden die optimalen Parameter für eine transiente Permeabilisierung
der Zellmembran evaluiert und für die Transfektion von Zelllinien sowie Primär-
und Stammzellen angewendet. Diese Parameter zeigten keine negativen Auswirkungen
auf die Nanopartikel, die Zellvitalität oder auf die einzubringenden Moleküle.
Die Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen lag bei unter
1 %. Kleinere Moleküle wie siRNA konnten mit einer Effizienz von mehr als 90 % bei
einer Zellvitalität von 93 % in die Zellen eingebracht werden. Durch eine siRNATransfektion
kam es in Tumorzellen zur Suppression des Onkogens HMGA2 um
50 %. Auch mit einem ps-Laser konnte eine effiziente Gensuppression in drei Zelllinien
mit verschiedenen siRNA bei geringer Konzentration (0,3 nM) erreicht werden.
Die Transfektion von primären Neuronen mit fluoreszenzmarkierter siRNA erfolgt mit
einer Effizienz von 70 %. Eine selektive Zellmanipulation wurde durch die gezielte
Bestrahlung oder durch Markierung der Zellen mit Nanopartikeln gezeigt. Ebenfalls
wurden zwei weitere Transfektionskonzepte für den Hochdurchsatz, mittels struktureller
Oberflächen und Glaskugeln, getestet. Grundlegende Untersuchungen deuten
auf Nahfeldeffekte als initialen Mechanismus der Membranpermeabilisierung hin. Es
wurden eine Öffnungszeit der Membran von 61 ms und eine minimale Porengröße
von 28 nm abgeschätzt, durch die Moleküle bis 2000 kDa ins Zytoplasma diffundierten.
Dabei hat die Ladung der Moleküle vermutlich einen Einfluss auf die Effizienz.
Mit der Entwicklung eines Funktionsmusters ist es gelungen, die plasmonenbasierte
Transfektion von kleinen Molekülen im Hochdurchsatz für Anwendungen in der Klinik
oder im Genlabor als Alternative einzusetzen. Die erzielten Ergebnisse stellen einen
erheblichen Fortschritt bei der Etablierung von laserbasierten Methoden dar und
eröffnen somit neue Wege in der Grundlagenforschung, der Molekularmedizin sowie
für die in vivo Anwendung.