Schlüsselwort: thermophile biotechnologisch-relevante Enzyme

Die Verwendung von Enzymen spielt bei vielen biotechnologischen Prozessen eine tragende Rolle. Aufgrund dessen ist die Identifizierung von Protein-kodierenden Genen, die für biotechnologisch-relevante Enzyme kodieren, weiterhin ein wichtiges Forschungsfeld. Ziel dieser Arbeit war die Verwendung einer kombinierten Omik-Analyse aus Metagenomik und Metatranskriptomik, um die Effizienz bei der Identifizierung von aktiven Glykosid-Hydrolase-kodierenden Genen zu erhöhen. Dafür wurden anaerobe, thermophile Mikroorganismen aus einer Sedimentprobe einer hydrothermalen Quelle von den Azoren auf gemahlenen grünen Kaffeebohnen als Kohlenstoffquelle bei 60 °C angereichert. Anschließend wurde die genomische DNA der Ausgangsprobe und die der Anreicherungskultur sowie die Gesamt-RNA der Anreicherungskultur extrahiert und mittels NGS-Hochdurchsatz-Sequenzierung sequenziert. Die Metagenom-Datensätze wurden für die Diversitäts-Analysen verwendet. Beim Vergleich der Diversitäten der GK-Anreicherungskultur und der HQ-Ausgangsprobe konnte eine geringe Abundanz der Archaeen von etwa 10 % ermittelt werden. Auf der Gattungs-Ebene wird deutlich, dass bekannte Polysaccharid-abbauende Mikroorganismen, wie Thermoanaerobacter und Dictyoglomus, auf gemahlenen grünen Kaffeebohnen angereichert werden konnten. Um Protein-kodierende Sequenzen (CDS) von Interesse aus dem Metagenom-Datensatz der Anreicherungskultur zu identifizieren, wurde zunächst der Ansatz der Sequenz-basierten Durchmusterung durchgeführt. Hierbei wurden 90.342 CDS nach ihrer Funktion in bestimmte Kategorien sortiert. Die Anzahl der CDS der für den Fokus dieser Arbeit interessanten Enzymklassen ergaben: 49 Cellulasen (EC 3.2.1.4), 49 Endo-1,4--Xylanasen (EC 3.2.1.8), 53 -Glukosidasen (EC 3.2.1.21) und vier Endo-1,4--Mannosidasen (EC 3.2.1.8). Dieser Ansatz wurde mittels Metatranskriptomik erweitert, um für alle CDS einen Expressionslevel zu bestimmen. So konnte gezeigt werden, welche Gene von den Organismen in der Anreicherungskultur aktiv als Antwort auf die vorhandenen Bedingungen transkribiert wurden. Für die Klonierung wurden die CDS, die in der jeweiligen EC-Klasse den höchsten Expressionslevel aufwiesen, ausgewählt. Gene, kodierend für zwei Endoglukanasen, eine -Glukosidase und eine Mannan Endo-1,4--Mannosidase, konnten erfolgreich kloniert, die Proteine heterolog produziert und biochemisch charakterisiert werden. Alle vier Enzyme zeigten Aktivitäten auf verschiedene Substrate und ein Temperatur-Optimum zwischen 80 und 90 °C. Im Gegensatz zum Sequenz-basierten Ansatz, bei dem alle CDS kloniert werden müssten, um aktive von nicht-aktiven Enzymen zu unterscheiden, konnte die zielgerichtete Suche nach aktiven Biokatalysatoren durch den kombinierten Omik-Ansatzes optimiert werden.