Die durch die parasitäre Klasse der Trematoden, speziell durch die Gattung Schistosoma ausgelöste Tropenparasitose Schistosomiasis zählt zu den wichtigsten tropischen Infektionskrankheiten. Zur Prävention und Therapie steht jedoch nur ein zugelassenes Medikament zur Verfügung, das seit den 1970er Jahren eingesetzt wird und dessen Wirksamkeit in den vergangenen Jahren nachgelassen hat. Die reelle Gefahr einer Resistenzentwicklung erfordert zwingend die Identifizierung neuer Wirkstoffe. Ein parasiten-basiertes Screening ist aufgrund des komplexen Lebenszyklus weniger geeignet. Eine effiziente Alternative stellt ein drug target-basiertes Wirkstoffscreening von lebenswichtigen Enzymen des Parasiten dar. Ein zielgerichtetes Screening ermöglicht zudem die Etablierung einer Plattformtechnologie, wodurch auch ähnliche Schlüsselenzyme anderer Parasiten gescreent werden können. Zur Realisierung einer Screeningplattform wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Enzyme aus Schistosoma mansoni ausgewählt und rekombinant mittels Baculovirus-Expressionssystem hergestellt. In diesem Zuge wurde ein Medienscreening durchgeführt und der Produktionsprozess hinsichtlich kritischer Prozessparameter optimiert. Der optimierte Produktionsprozess wurde anschließend auf einen 1 L Bioreaktor-Maßstab übertragen. Für die Integration in enzymatische Aktivitätstests wurden beide Enzyme aufgereinigt und für eines der Enzyme ein Aktivitätstest ausgelegt. Zur Steigerung der Enzymaktivität wurde der Effekt von bivalenten Kationen getestet, optimale Umgebungsbedingungen untersucht und die kinetischen Konstanten bestimmt. Mit einem abschließenden in vitro Screening konnten drei vielversprechende Substanzen ermittelt werden, die einen inhibitorischen Effekt zwischen 80-100 % erreichten.
Aktualisiert: 2022-07-19
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Die zunehmde Ausbreitung antibiotikaresistenter Erreger macht die Entwicklung neuer Wirkstoffklassen oder alternativer Strategien unabdingbar. Vielversprechende Kandidaten als neuartige Wirkstoffe sind dabei antimikrobielle Peptide (AMPs) aus Insekten, die so divers sind wie die Klasse der Insekten selbst und deren Vertreter unterschiedliche Wirkspektren gegen eine Vielzahl von Mikroben aufweisen. Um Insekten-AMPs für Forschung und Medizin nutzbar zu machen, müssen sie in großen Mengen rekombinant hergestellt werden. Viele AMPs sind jedoch toxisch gegenüber potenziellen Expressionswirten oder beinhalten Disulfidbrücken, was die Expression zu einer Herausforderung macht. Die optimale Kombination aus Expressionsstamm und -plasmid (Promotor, Fusionspartner) muss dabei für jedes AMP empirisch ermittelt werden.
In dieser Arbeit wurde daher ein Expressionsscreening in E. coli entwickelt, mit dem für jedes AMP systematisch nach den Parametern gesucht werden kann, mit denen eine maximal hohe lösliche Proteinausbeute erzielt wird. Variiert wurden dabei die Elemente, aus denen das Expressionsplasmid aufgebaut ist, wie Promotor und Fusionspartner, sowie der Bakterienstamm. Dazu wurde mithilfe der Golden Gate-Klonierung eine kombinatorische Plasmidbibliothek aufgebaut, innerhalb derer durch die einfache und parallelisierbare Klonierungstechnik eine freie Kombination von Plasmidelementen zu Expressionsplasmiden möglich ist. Für drei Modell-AMPs mit unterschiedlichen Charakteristika wurde die Effizienz der Klonierung untersucht und das Expressionsscreening durchgeführt.
Für Insekten-AMPs, die sich aufgrund ihrer Eigenschaften nicht in E. coli exprimieren lassen, wurde ein Protokoll zur Herstellung stabil exprimierender, monoklonaler Schneider 2-Insektenzelllinien etabliert.
Aktualisiert: 2020-12-08
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