Autor: Rebecca Claßen

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind die größte Rezeptorfamilie des Menschen und an der Steuerung wichtiger physiologischer Funktionen beteiligt. Daher greift eine Vielzahl von Medikamenten an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an. Nanopartikel (NPs), die aktuell ein großes Interesse in der biomedizinischen Forschung erfahren, können mit Liganden dieser Rezeptoren funktionalisiert werden. Die funktionalisierten Nanopartikel können im Vergleich zur „klassischen“ Applikationsform von pharmakologisch wirksamen Einzelmolekülen zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem besseren Transport von Wirkstoffen über biologische Barrieren und möglicherweise einer Reduktion der Nebenwirkungen führen. In meinem Projekt wurde neben Carbachol-, Adrenalin- bzw. Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln auch die Wirkung von Goldnanopartikeln, welche mit dem muskarinergen Rezeptorantagonisten Atropin funktionalisiert waren, untersucht. Ziel meiner Arbeit war dabei, herauszufinden, ob die biofunktionalisierten Goldnanopartikel an typischen Zielgeweben mit adrenergen oder cholinergen Rezeptoren wirksam sind. Die adrenerg funktionalisierten NPs waren in der Lage, am Kolonepithel, das mehrere Subtypen von β-Rezeptoren exprimiert, eine K+-Sekretion auszulösen. Experimente an isolierten Kardiomyozyten ergaben, dass sie in der Lage sind, β1-Rezeptoren zu stimulieren, wodurch sie an den Herzmuskelzellen die Inotropie steigern (hemmbar durch den β1-Rezeptorblocker Atenolol). Glattmuskuläre β2-Rezeptoren, die therapeutisch bei der Behandlung des Asthma bronchiale einen zentralen Angriffspunkt darstellen, werden von Adrenalin- oder Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln allerdings nicht stimuliert, wie Organbad-Versuche zur Messung der isometrischen Kraftentwicklung von isolierten Tracheal- und Bronchialringen zeigten. Eine Bronchodilatation durch Atropin-funktionalisierte NPs war hingegen durch subnanomolare Konzentrationen dieser Partikel möglich. Um die Passagefähigkeit durch das Darmepithel, die eine entscheidende Voraussetzung für eine orale Bioverfügbarkeit der NPs wäre, zu untersuchen, wurden zwei Ansätze gewählt. Dabei wurde bestimmt, ob Atropin-NPs nach mukosaler Applikation Muskarinrezeptoren auf der basolateralen Membran von Epithelzellen bzw. auf der glatten Muskulatur der Tunica muscularis hemmen können. In der Tat verminderten mit Atropin funktionalisierte NPs zeitabhängig sowohl die durch das stabile Acetylcholinderivat Carbachol ausgelöste Cl--Sekretion als auch Kontraktionen, die durch Stimulation cholinerger Neurone des enterischen Nervensystems (ausgelöst durch elektrische Feldstimulation) induziert wurden. Die systematische Variation des Goldkerndurchmessers im Bereich von 8 bis 16 nm in 1 bis 2 nm großen Schritten ergab eine glockenförmige Abhängigkeit der Hemmwirkung von Atropin-NPs an Muskarinrezeptoren mit einem Optimum zwischen 12 und 14 nm. Der Nachweis von Goldnanopartikeln in transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Inkubation von Zellen mit den Nanopartikeln spricht dafür, dass die funktionalisierten Nanopartikel wahrscheinlich per Endozytose in Zellen aufgenommen werden. Eine massive Potenzierung im Sinne einer Steigerung der Affinität wurde – wie schon aus vorherigen Publikationen meiner Arbeitsgruppe aus Experimenten am Darmepithel bekannt – für Nanopartikel beobachtet, die mit Carbachol funktionalisiert worden waren. Sie induzierten in meinen Experimenten schon in pikomolaren Konzentrationen einen Anstieg der isometrisch gemessenen Muskelkraft intestinaler Längsmuskelpräparate und führten an isolierten Kolonkrypten zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration, der zeitlich gesehen deutlich stabiler ausfiel als derjenige, der durch natives Carbachol ausgelöst wurde. Die Ergebnisse meines Projekts zeigen, dass cholinerg und adrenerg funktionalisierte Goldnanopartikel an den adressierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (wenn auch nicht an allen, wie im Fall von β2-Rezeptoren) abhängig von ihrem Durchmesser wirksam sind. Sie sind außerdem in der Lage, zeitabhängig das Darmepithel zu passieren. Damit erfüllen sie prinzipielle Voraussetzungen für die weitere Prüfung ihrer Anwendungsmöglichkeit z.B. zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinal- oder des Respirationstrakts.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind die größte Rezeptorfamilie des Menschen und an der Steuerung wichtiger physiologischer Funktionen beteiligt. Daher greift eine Vielzahl von Medikamenten an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an. Nanopartikel (NPs), die aktuell ein großes Interesse in der biomedizinischen Forschung erfahren, können mit Liganden dieser Rezeptoren funktionalisiert werden. Die funktionalisierten Nanopartikel können im Vergleich zur „klassischen“ Applikationsform von pharmakologisch wirksamen Einzelmolekülen zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem besseren Transport von Wirkstoffen über biologische Barrieren und möglicherweise einer Reduktion der Nebenwirkungen führen. In meinem Projekt wurde neben Carbachol-, Adrenalin- bzw. Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln auch die Wirkung von Goldnanopartikeln, welche mit dem muskarinergen Rezeptorantagonisten Atropin funktionalisiert waren, untersucht. Ziel meiner Arbeit war dabei, herauszufinden, ob die biofunktionalisierten Goldnanopartikel an typischen Zielgeweben mit adrenergen oder cholinergen Rezeptoren wirksam sind. Die adrenerg funktionalisierten NPs waren in der Lage, am Kolonepithel, das mehrere Subtypen von β-Rezeptoren exprimiert, eine K+-Sekretion auszulösen. Experimente an isolierten Kardiomyozyten ergaben, dass sie in der Lage sind, β1-Rezeptoren zu stimulieren, wodurch sie an den Herzmuskelzellen die Inotropie steigern (hemmbar durch den β1-Rezeptorblocker Atenolol). Glattmuskuläre β2-Rezeptoren, die therapeutisch bei der Behandlung des Asthma bronchiale einen zentralen Angriffspunkt darstellen, werden von Adrenalin- oder Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln allerdings nicht stimuliert, wie Organbad-Versuche zur Messung der isometrischen Kraftentwicklung von isolierten Tracheal- und Bronchialringen zeigten. Eine Bronchodilatation durch Atropin-funktionalisierte NPs war hingegen durch subnanomolare Konzentrationen dieser Partikel möglich. Um die Passagefähigkeit durch das Darmepithel, die eine entscheidende Voraussetzung für eine orale Bioverfügbarkeit der NPs wäre, zu untersuchen, wurden zwei Ansätze gewählt. Dabei wurde bestimmt, ob Atropin-NPs nach mukosaler Applikation Muskarinrezeptoren auf der basolateralen Membran von Epithelzellen bzw. auf der glatten Muskulatur der Tunica muscularis hemmen können. In der Tat verminderten mit Atropin funktionalisierte NPs zeitabhängig sowohl die durch das stabile Acetylcholinderivat Carbachol ausgelöste Cl--Sekretion als auch Kontraktionen, die durch Stimulation cholinerger Neurone des enterischen Nervensystems (ausgelöst durch elektrische Feldstimulation) induziert wurden. Die systematische Variation des Goldkerndurchmessers im Bereich von 8 bis 16 nm in 1 bis 2 nm großen Schritten ergab eine glockenförmige Abhängigkeit der Hemmwirkung von Atropin-NPs an Muskarinrezeptoren mit einem Optimum zwischen 12 und 14 nm. Der Nachweis von Goldnanopartikeln in transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Inkubation von Zellen mit den Nanopartikeln spricht dafür, dass die funktionalisierten Nanopartikel wahrscheinlich per Endozytose in Zellen aufgenommen werden. Eine massive Potenzierung im Sinne einer Steigerung der Affinität wurde – wie schon aus vorherigen Publikationen meiner Arbeitsgruppe aus Experimenten am Darmepithel bekannt – für Nanopartikel beobachtet, die mit Carbachol funktionalisiert worden waren. Sie induzierten in meinen Experimenten schon in pikomolaren Konzentrationen einen Anstieg der isometrisch gemessenen Muskelkraft intestinaler Längsmuskelpräparate und führten an isolierten Kolonkrypten zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration, der zeitlich gesehen deutlich stabiler ausfiel als derjenige, der durch natives Carbachol ausgelöst wurde. Die Ergebnisse meines Projekts zeigen, dass cholinerg und adrenerg funktionalisierte Goldnanopartikel an den adressierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (wenn auch nicht an allen, wie im Fall von β2-Rezeptoren) abhängig von ihrem Durchmesser wirksam sind. Sie sind außerdem in der Lage, zeitabhängig das Darmepithel zu passieren. Damit erfüllen sie prinzipielle Voraussetzungen für die weitere Prüfung ihrer Anwendungsmöglichkeit z.B. zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinal- oder des Respirationstrakts.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind die größte Rezeptorfamilie des Menschen und an der Steuerung wichtiger physiologischer Funktionen beteiligt. Daher greift eine Vielzahl von Medikamenten an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an. Nanopartikel (NPs), die aktuell ein großes Interesse in der biomedizinischen Forschung erfahren, können mit Liganden dieser Rezeptoren funktionalisiert werden. Die funktionalisierten Nanopartikel können im Vergleich zur „klassischen“ Applikationsform von pharmakologisch wirksamen Einzelmolekülen zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem besseren Transport von Wirkstoffen über biologische Barrieren und möglicherweise einer Reduktion der Nebenwirkungen führen. In meinem Projekt wurde neben Carbachol-, Adrenalin- bzw. Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln auch die Wirkung von Goldnanopartikeln, welche mit dem muskarinergen Rezeptorantagonisten Atropin funktionalisiert waren, untersucht. Ziel meiner Arbeit war dabei, herauszufinden, ob die biofunktionalisierten Goldnanopartikel an typischen Zielgeweben mit adrenergen oder cholinergen Rezeptoren wirksam sind. Die adrenerg funktionalisierten NPs waren in der Lage, am Kolonepithel, das mehrere Subtypen von β-Rezeptoren exprimiert, eine K+-Sekretion auszulösen. Experimente an isolierten Kardiomyozyten ergaben, dass sie in der Lage sind, β1-Rezeptoren zu stimulieren, wodurch sie an den Herzmuskelzellen die Inotropie steigern (hemmbar durch den β1-Rezeptorblocker Atenolol). Glattmuskuläre β2-Rezeptoren, die therapeutisch bei der Behandlung des Asthma bronchiale einen zentralen Angriffspunkt darstellen, werden von Adrenalin- oder Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln allerdings nicht stimuliert, wie Organbad-Versuche zur Messung der isometrischen Kraftentwicklung von isolierten Tracheal- und Bronchialringen zeigten. Eine Bronchodilatation durch Atropin-funktionalisierte NPs war hingegen durch subnanomolare Konzentrationen dieser Partikel möglich. Um die Passagefähigkeit durch das Darmepithel, die eine entscheidende Voraussetzung für eine orale Bioverfügbarkeit der NPs wäre, zu untersuchen, wurden zwei Ansätze gewählt. Dabei wurde bestimmt, ob Atropin-NPs nach mukosaler Applikation Muskarinrezeptoren auf der basolateralen Membran von Epithelzellen bzw. auf der glatten Muskulatur der Tunica muscularis hemmen können. In der Tat verminderten mit Atropin funktionalisierte NPs zeitabhängig sowohl die durch das stabile Acetylcholinderivat Carbachol ausgelöste Cl--Sekretion als auch Kontraktionen, die durch Stimulation cholinerger Neurone des enterischen Nervensystems (ausgelöst durch elektrische Feldstimulation) induziert wurden. Die systematische Variation des Goldkerndurchmessers im Bereich von 8 bis 16 nm in 1 bis 2 nm großen Schritten ergab eine glockenförmige Abhängigkeit der Hemmwirkung von Atropin-NPs an Muskarinrezeptoren mit einem Optimum zwischen 12 und 14 nm. Der Nachweis von Goldnanopartikeln in transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Inkubation von Zellen mit den Nanopartikeln spricht dafür, dass die funktionalisierten Nanopartikel wahrscheinlich per Endozytose in Zellen aufgenommen werden. Eine massive Potenzierung im Sinne einer Steigerung der Affinität wurde – wie schon aus vorherigen Publikationen meiner Arbeitsgruppe aus Experimenten am Darmepithel bekannt – für Nanopartikel beobachtet, die mit Carbachol funktionalisiert worden waren. Sie induzierten in meinen Experimenten schon in pikomolaren Konzentrationen einen Anstieg der isometrisch gemessenen Muskelkraft intestinaler Längsmuskelpräparate und führten an isolierten Kolonkrypten zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration, der zeitlich gesehen deutlich stabiler ausfiel als derjenige, der durch natives Carbachol ausgelöst wurde. Die Ergebnisse meines Projekts zeigen, dass cholinerg und adrenerg funktionalisierte Goldnanopartikel an den adressierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (wenn auch nicht an allen, wie im Fall von β2-Rezeptoren) abhängig von ihrem Durchmesser wirksam sind. Sie sind außerdem in der Lage, zeitabhängig das Darmepithel zu passieren. Damit erfüllen sie prinzipielle Voraussetzungen für die weitere Prüfung ihrer Anwendungsmöglichkeit z.B. zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinal- oder des Respirationstrakts.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind die größte Rezeptorfamilie des Menschen und an der Steuerung wichtiger physiologischer Funktionen beteiligt. Daher greift eine Vielzahl von Medikamenten an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an. Nanopartikel (NPs), die aktuell ein großes Interesse in der biomedizinischen Forschung erfahren, können mit Liganden dieser Rezeptoren funktionalisiert werden. Die funktionalisierten Nanopartikel können im Vergleich zur „klassischen“ Applikationsform von pharmakologisch wirksamen Einzelmolekülen zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem besseren Transport von Wirkstoffen über biologische Barrieren und möglicherweise einer Reduktion der Nebenwirkungen führen. In meinem Projekt wurde neben Carbachol-, Adrenalin- bzw. Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln auch die Wirkung von Goldnanopartikeln, welche mit dem muskarinergen Rezeptorantagonisten Atropin funktionalisiert waren, untersucht. Ziel meiner Arbeit war dabei, herauszufinden, ob die biofunktionalisierten Goldnanopartikel an typischen Zielgeweben mit adrenergen oder cholinergen Rezeptoren wirksam sind. Die adrenerg funktionalisierten NPs waren in der Lage, am Kolonepithel, das mehrere Subtypen von β-Rezeptoren exprimiert, eine K+-Sekretion auszulösen. Experimente an isolierten Kardiomyozyten ergaben, dass sie in der Lage sind, β1-Rezeptoren zu stimulieren, wodurch sie an den Herzmuskelzellen die Inotropie steigern (hemmbar durch den β1-Rezeptorblocker Atenolol). Glattmuskuläre β2-Rezeptoren, die therapeutisch bei der Behandlung des Asthma bronchiale einen zentralen Angriffspunkt darstellen, werden von Adrenalin- oder Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln allerdings nicht stimuliert, wie Organbad-Versuche zur Messung der isometrischen Kraftentwicklung von isolierten Tracheal- und Bronchialringen zeigten. Eine Bronchodilatation durch Atropin-funktionalisierte NPs war hingegen durch subnanomolare Konzentrationen dieser Partikel möglich. Um die Passagefähigkeit durch das Darmepithel, die eine entscheidende Voraussetzung für eine orale Bioverfügbarkeit der NPs wäre, zu untersuchen, wurden zwei Ansätze gewählt. Dabei wurde bestimmt, ob Atropin-NPs nach mukosaler Applikation Muskarinrezeptoren auf der basolateralen Membran von Epithelzellen bzw. auf der glatten Muskulatur der Tunica muscularis hemmen können. In der Tat verminderten mit Atropin funktionalisierte NPs zeitabhängig sowohl die durch das stabile Acetylcholinderivat Carbachol ausgelöste Cl--Sekretion als auch Kontraktionen, die durch Stimulation cholinerger Neurone des enterischen Nervensystems (ausgelöst durch elektrische Feldstimulation) induziert wurden. Die systematische Variation des Goldkerndurchmessers im Bereich von 8 bis 16 nm in 1 bis 2 nm großen Schritten ergab eine glockenförmige Abhängigkeit der Hemmwirkung von Atropin-NPs an Muskarinrezeptoren mit einem Optimum zwischen 12 und 14 nm. Der Nachweis von Goldnanopartikeln in transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Inkubation von Zellen mit den Nanopartikeln spricht dafür, dass die funktionalisierten Nanopartikel wahrscheinlich per Endozytose in Zellen aufgenommen werden. Eine massive Potenzierung im Sinne einer Steigerung der Affinität wurde – wie schon aus vorherigen Publikationen meiner Arbeitsgruppe aus Experimenten am Darmepithel bekannt – für Nanopartikel beobachtet, die mit Carbachol funktionalisiert worden waren. Sie induzierten in meinen Experimenten schon in pikomolaren Konzentrationen einen Anstieg der isometrisch gemessenen Muskelkraft intestinaler Längsmuskelpräparate und führten an isolierten Kolonkrypten zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration, der zeitlich gesehen deutlich stabiler ausfiel als derjenige, der durch natives Carbachol ausgelöst wurde. Die Ergebnisse meines Projekts zeigen, dass cholinerg und adrenerg funktionalisierte Goldnanopartikel an den adressierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (wenn auch nicht an allen, wie im Fall von β2-Rezeptoren) abhängig von ihrem Durchmesser wirksam sind. Sie sind außerdem in der Lage, zeitabhängig das Darmepithel zu passieren. Damit erfüllen sie prinzipielle Voraussetzungen für die weitere Prüfung ihrer Anwendungsmöglichkeit z.B. zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinal- oder des Respirationstrakts.