Schlüsselwort: CLECs

In biotechnologischen Prozessen bietet die Nutzung von immobilisierten Enzymen in Form von quervernetzten Proteinkristallen (CLECs) viele Vorteile, wie eine hohe volumenspezifische katalytische Aktivität und größere Resistenz gegenüber chemischen und enzymatischen Angriffen. Voraussetzung für eine Prozessierbarkeit und Wiederverwendbarkeit der Immobilisate ist jedoch neben dem Erhalt der enzymatischen Aktivität der Proteinkristalle deren mechanische Stabilität. Dabei hängen mechanische Stabilität wie auch Enzymaktivität einerseits eng mit der Kristallstruktur und somit mit der Aminosäuresequenz der Proteine, andererseits mit dem gewählten Vernetzungsreagenz und -grad zusammen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, Zusammenhänge zwischen der Enzymstruktur und den resultierenden Eigenschaften von CLECs aufzuklären. Da die Strukturbildung der CLECs durch die einzelnen Prozessschritte des gesamten Herstellungsprozesses, beginnend mit der genetischen Modifikation über Produktion und Reinigung der Enzyme, der Kristallerzeugung und -charakterisierung bis zur Formulierung beeinflusst wird, muss diese auch als Ganzes in die Betrachtungen einbezogen werden. Als Basis für die Untersuchungen wurden mittels verschiedener Protein Engineering Methoden Aminosäuren auf der Oberfläche des gefalteten Wildtyp Enzyms ausgetauscht, um neue potentielle Vernetzungsstellen innerhalb der später hergestellten Proteinkristalle einzubauen und somit die mechanischen Kristalleigenschaften zu verbessern. Das hierfür eingesetzte, industriell relevante Modellprotein, die Halohydrindehalogenase, wurde im Rahmen einer Kooperation am Institut für Biochemie der Technischen Universität Braunschweig genetisch modifiziert, hergestellt und charakterisiert. Der Fokus dieser Arbeit lag dabei auf der Entwicklung von Methoden zur Kristallisation, der Quervernetzung und der anschließenden mechanischen Charakterisierung. Auf Basis des Einflusses der genetischen Mutation sowie ausgewählter Formulierungsparameter und der hieraus resultierenden strukturellen Proteineigenschaften wurde ein statistisches Modell zur Aufklärung der Struktur-Eigenschaftsbeziehung von CLECs abgeleitet. Basis des statistischen Modells bildet die dreidimensionale Kristallstruktur mit allen relevanten Aminosäuren, die mit dem gewählten Vernetzungsmolekül innerhalb der spezifischen Länge des Linkers mögliche Vernetzungsbindungen ausbilden können. Die Anteile aller möglichen Brücken innerhalb des Kristalls in die jeweilige Belastungsrichtung wurden aufsummiert, um das mechanische Verhalten der CLECs zu beschreiben. Hierüber konnten die Zusammenhänge, wie z. B. das anisotrope Kristallverhalten bzw. der Einfluss des Linkers oder der Mutation, auf das mechanische Verhalten wiedergegeben werden. Um die Gültigkeit des Modells zu validieren, wurden mechanische Eigenschaften nativer Kristalle und der CLECs, wie bspw. Härte, E-Modul und elasto-plastische Verformungsarbeiten auf unterschiedlichen Größenskalen mittels Rasterkraftmikroskopie und Nanoindentation untersucht. Eine besondere Herausforderung lag auf der Methodenetablierung für eine zuverlässige, statistisch abgesicherte mechanische Charakterisierung von Biopartikeln in geringem Flüssigkeitsvolumen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit vermitteln ein Verständnis der zugrundeliegenden Wechselwirkungen, Zusammenhänge und Limitierungen zwischen der Struktur und den Eigenschaften von quervernetzten Proteinkristallen und können daher als ein grundlegender Baustein für die Herstellung von maßgeschneiderten CLECs genutzt werden.