Neuronale Differenzierung caniner mesenchymaler Stammzellen aus dem Fettgewebe über den Zwischenschritt der Bildung dreidimensionaler Sphären

Der Einsatz regenerativer Therapien und insbesondere eine Nutzung von cMSCs zur Behandlung neurologischer Erkrankungen des Hundes ist sehr vielversprechend. Dennoch ist die genaue Rolle, welche cMSCs während des Heilungsprozesses innehaben könnten, bisher weitestgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern cMSCs nach einer erfolgten neuronalen Differenzierung neuronale Eigen¬schaften aufweisen. Dazu wurde in einem Zwischen¬schritt die Bildung dreidimensionaler Sphären, welche Neurosphären imitieren sollten, angeregt. Bei den verwendeten Diffe-renzierungsmedien erfolgte eine starke Orientierung an denen, welche zur Kultivierung caniner neuronaler Zellen verwendet werden. Dies und der Zwischenschritt einer Sphärenbildung sollten ein möglichst physiologisches Milieu zur Dif¬fe¬renzierung der Zellen schaffen.
Dazu wurden cMSCs aus dem Fettgewebe gewonnen und nach ihrer erfolgreichen Charakterisierung in einem neuronalen Prädifferenzierungsmedium, bestehend aus Basismedium, Supplementen und Wachs¬tumsfaktoren, für 3 Tage zur Sphärenbildung angeregt. Als Basismedium wurde DMEM/F-12 verwendet, bei den genutzten Supplementen handelte es sich um N2 und B-27 und als Wachstumsfaktoren wurden EGF und bFGF hinzugegeben. Versuchsweise erfolgte ein Zusatz von Natrium-Heparin. Der fehlende Zusatz von Serum und eine antiadhäsive Ober¬flächen¬beschichtung waren entscheidend für die Sphäreninduktion. Es erfolgte eine Untersuchung der Sphären hingehend ihrer Morphologie und Vitalität. Hierdurch sollte ein Vergleich mit Neurosphären ermöglicht werden. Durch die Analyse metrischer Aspekte wurde der Einfluss verschiedener Medienkomponenten auf die Sphärenbildung beurteilt.
Anschließend erfolgte die siebentägige neuronale Weiterdifferenzierung der Sphären. Dazu wurden diese in Weiterdifferenzierungsmedium auf einer adhäsiven Oberfläche kultiviert. Das Medium setzte sich aus dem gleichen Basismedium und Supplementen zusammen. Außerdem erfolgte eine Zugabe von 2,5 % FKS und die Wachstumsfaktoren wurden durch die Neuro¬trophine NGF und BDNF ersetzt. Der FKS-Zusatz und die Kultivierung der Sphären auf einer adhäsiven Oberfläche waren entscheiden für das Anwachsen und Auswandern der Zellen. Im Anschluss erfolgte eine morphologische Beurteilung der Zellen.
Undifferenzierte cMSCs, Sphären und cMSCs nach viertägiger und siebentägiger Weiter-dif¬fe¬ren¬zie¬rung wurden mittels RT-qPCR, Immunfluoreszenz und Western Blot hingehend ihrer Expression neuronaler Marker untersucht.

Im Folgenden sind die relevanten Ergebnisse aufgeführt:
– Eine effektive Sphärenbildung erfolgte nur, sofern Silikonpads als antiadhäsive Ober¬fläche verwendet wurden.
– Ein Zusatz von FKS während der Prädifferenzierung führte zum Anwachsen der cMSCs auf den Silikonpads.
– Die Zugabe unterschiedlicher Supplemente hatte keinen großen Einfluss auf Größe oder Anzahl der Sphären.
– Sphärengröße und Zellzahl wiesen eine positive Korrelation zueinander auf.
– Besonders in den ersten 48 Stunden fand eine Proliferation der Sphären statt.
– Die Sphären waren vital, proliferierten und wiesen nur einen geringen Anteil toter Zellen auf.
– Die Sphären wiesen ultrastrukturelle Ähnlichkeiten zu Neurosphären auf.
– Eine Adhäsion der Sphären und die Auswanderung von Zellen erfolgte mit Zugabe von 2,5 % FKS und auf einer mit Agarose beschichteten Oberfläche.
– Die neuronal weiterdifferenzierten MSCs wiesen eine unterschiedliche Morpho¬logie auf, welche sowohl auf eine neuronale, als auch auf eine gliale Dif¬fe¬ren¬zie¬rung hindeutete. Wenige Spender zeigten eine Rückkehr zur Stammzellen-ähnlichen Morphologie.
– Die in der RT-qPCR untersuchten neuronalen Marker zeigten auch bei den undiffe-ren¬zierten cMSCs eine basale Expression.
– Es gab Hinweise darauf, dass eine Nestinexpression ein Merkmal multipotenter Progenitorzellen ist und auf eine erhöhte Zellproliferation hinweist. Die Rolle Nestins als Marker neuronaler Vorläuferzellen rückt damit weiter in den Hinter-grund.
– Bei der Untersuchung der Expression der neuronalen Marker konnten Hinweise auf eine beginnende neuronale Differenzierung der Zellen gefunden werden. Es ist wahr¬scheinlich, dass während der Weiterdifferenzierung eine Verdrängung der sich in die neuronale Richtung entwickelnden Zellen durch glial differenzierende Zellen statt¬fand. Dennoch gab es Hinweise, dass teilweise eine weitergehende neuronale Differenzierung weniger Zellen erfolgte. Häufig traten Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen der Immunfluoreszenz und der RT-qPCR auf, welche wahrscheinlich auf eine Verminde¬rung der Genexpression bei hohem Vor¬kom¬men des Proteins innerhalb der Zelle zurückzuführen waren.
Insgesamt zeigt die vorliegende Arbeit, dass die differenzierten cMSCs durchaus Hinweise auf eine beginnende und fortschreitende neuronale Differenzierung aufweisen. Dabei sind größere interindividuelle Unterschiede auffällig. Weiterhin ist zu beachten, dass am siebten Tag der Weiterdifferenzierung vermutlich eine Verdrängung durch glial-differenzierende Zellen erfolg¬te, da wenig MAP2-positive Zellen mit Fortsätzen zu beobachten waren und die Mehrzahl der Zellen A2B5-positiv war. Die Sphären bestätigen durch ihre ultrastrukturelle Morphologie, Ergebnisse der Vitalitätstests und Expression von Nestin und β-III Tubulin den proliferativen Neurosphären-ähnlichen Charakter. Es ist jedoch anzumerken, dass bei der alleinigen Unter¬suchung der Expression bestimmter neuronaler Marker einige Aspekte der neuronalen Identitiät wie beispielsweise ihre Aktivität außer Acht gelassen werden. Fraglich ist weiterhin, ob eine vollständige Diffe¬renzierung der cMSCs zu spezifischen Neuronentypen, die ein bestimmtes, sie umgebendes, Mikromilieu benötigen, möglich ist. Jedoch wird dies für die therapeutische Verwendung der Zellen nicht nötig sein, da die Applikation undifferenzierter bzw. vor¬dif¬fe¬ren¬zierter Zellen wahrscheinlich einige Vorteile mit sich bringt. Außerdem wird in Zukunft vorraussichtlich die Rolle der MSCs als immunmodulatrisch wirkende „medicinal signaling cells“, welche die Regeneration geschädigter Gewebe unterstützen, im Vordergrund stehen.
In der Arbeit wurde weiterhin eine Methode entwickelt cMSCs durch Kultivierung auf Silikonpads zur Bildung drei¬dimensionaler Sphären anzuregen. Die Silikonpads stellen eine einfache und sehr effektive Möglichkeit dar, die Zellen in einer 3D-Kultur zu halten und könnten künftig auch bei der Kultivierung anderer Zellen von Nutzen sein.