Etablierung und Optimierung der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion beim Rind

Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) beim Rind benötigt zur Entwicklung der Embryonen ein geeignetes Aktivierungsverfahren. Die Problematik besteht jedoch beim Rind darin, dass so auch parthenogenetische entstehen, welche morphologisch nicht von tatsächlich befruchteten Stadien zu unterscheiden sind. Ziel dieser Arbeit war es, eine paternale Beteiligung nach der ICSI nachzuweisen und somit die tatsächliche Befruchtung. Dazu mussten die parthenogenetischen Entwicklungsstadien von den tatsächlich befruchteten unterschieden werden. Für eine erste Einschätzung wurden die Zygoten 18 Stunden nach der initialen Aktivierung mit Hoechst 33342 oder mit Hoechst und dem MitoTracker Green FM® gefärbt. Der MitoTracker Green FM® ermöglichte eine Zuordnung des Spermienmittelstücks und identifizierte somit den paternalen Vorkern. Die Ergebnisse wurden sowohl für die ICSI-Gruppe als auch für die Kontrollgruppen bestehend aus einer In-vitro-Fertilisations- (IVF), Chemisch-aktivierten- (CA), CA und Sham-injizierten- (Sham) Gruppe verglichen. Die erfolgreiche haploide Aktivierung wurde durch das Ausschleusen des zweiten Polköpers bestätigt. Zudem erfolgte ein Vergleich der Ergebnisse der Embryonen der diploid und der haploid aktivierten Gruppen, sowohl mit denen, die mit gesextem als auch ungesextem Sperma erstellt wurden. Die Erhebung der Teilungs- und Entwicklungsraten für alle Gruppen und deren Vergleich ließen somit Rückschlüsse auf den Anteil an parthenogenetischen Entwicklungsstadien zu. Zusätzlich erfolgten Versuche mit Y-chromosomal-gesextem Sperma durchgeführt. An Tag sieben oder acht wurden Embryonen für die RT-qPCR aus den Versuchen mit gesextem und ungesextem Sperma eingefroren. Auf molekularer Ebene fand die Erfassung der Transkriptmengen von sieben entwicklungsrelevanten Genen (DNMT1, DNMT3a, IGF2R, G6PD, NNAT, BAX und BCL2L1) statt. An einer repräsentativen Stichprobe an Embryonen wurde das Geschlecht der Embryonen durch eine PCR ermittelt, um somit einen Rückschluss auf den Anteil parthenogenetischer Entwicklungsstadien zu erhalten. Bei Embryonen der ICSI-Gruppe, welche mit Y-chromosomal-gesextem Sperma erzeugt wurden, stellt der Anteil an männlichen Embryonen den Anteil der tatsächlich befruchteten Embryonen dar. Die Durchführung einer RT-qPCR, die die relative Transkriptmenge eines paternales Gentranskriptes wie bspw. NNAT ermittelte und lieferte somit einen Nachweis der paternale Beteiligung. Zum anderen erfolgte der Vergleich der Qualität der Embryonen der CA, Sham-, ICSI- und IVF-Gruppe über die Untersuchung unterschiedlicher Transkripte wie bspw. IGF2R, BCL2L1 und BAX als Qualitätsmarker.
Es konnten folgende Ergebnisse erzielt werden:
1. Färbung mit Hoechst 33343:
a. In der ICSI-Gruppe waren 26,2 % normal und erfolgreich befruchtet (2PN/2PB)
b. In der IVF-Gruppe waren 60,5 % normal und erfolgreich befruchtet (2PN/2PB)
c. In der CA-Gruppe waren 78,4 % korrekt aktiviert (2PB und 1PN)
d. In der Sham-Gruppe mit Aktivierung waren 24,8 % korrekt aktiviert (2PB und 1PN)
2. Färbung mit Hoechst 33343 und MitoTracker Green FM®:
a. In der ICSI-Gruppe waren 45,5 % normal und erfolgreich befruchtet (2PB+2PN+Mittelstück des Spermiums)
b. In der IVF-Gruppe waren 50,5 % normal und erfolgreich befruchtet (2PB+2PN+ Mittelstück des Spermiums)
3. Teilungsraten:
a. Bei den Embryonen der diploiden Gruppe waren signifikante Unterschiede zwischen denen der ICSI- (53,7 %) und denen der IVF- (70,5 %) und denen der Sham-Gruppe mit chemischer Aktivierung (44,3 %) feststellbar.
b. Bei den Embryonen der haploid aktivierten Gruppe lagen signifikante Unterschiede zwischen denen der ICSI (41,9 %) und der Sham-Gruppe (4,5 %), sowie zu der IVF-Gruppe (67,7 %) vor.
c. Der Vergleich der Embryonen der haploid aktivierten und der diploid aktivierten Gruppen ergab signifikante Unterschiede zwischen den beiden ICSI-Gruppen (diploid: 53,7 %; haploid: 41,9 %)
d. Bei den Embryonen der ICSI-Gruppe mit haploider Aktivierung und denen mit gesextem Sperma waren signifikante Unterschiede zwischen X-chromosomal gesextem Sperma (51,2 %) und Y-chromosomal gesextem Sperma des Bullen zwei (40,9 %) vorhanden. Zudem lagen signifikante Unterschiede zwischen Y-gesextem Sperma des Bullen zwei (40,9 %) und drei (28,5 %) vor.
4. Entwicklungsraten:
a. In der diploid aktivierten Gruppe wiesen die Embryonen der CA-Gruppe (18,7 %) im Vergleich zu denen der ICSI-Gruppe keine große Abweichung auf (24,1 %), somit enthält die ICSI-Gruppe wahrscheinlich einen hohen Anteil parthenogenetischer Entwicklungsstadien.
b. Die reine Sham-Injektion führte weder zu Teilungs- noch zu Entwicklungsraten, es fand also keinerlei Entwicklung der Embryonen statt.
c. Bei den Embryonen der haploid aktivierten Gruppe wiesen die der IVF-Gruppe (31,7 %) signifikante Unterschiede gegenüber denen der CA- (9,2 %) und der ICSI-Gruppe (14,8 %) auf.
d. Der Vergleich der Embryonen der haploid und der diploid aktivierten Gruppen ergab signifikante Unterschiede zwischen denen der IVF-Gruppe und beiden CA-Gruppen (IVF: 31,7 %; diploid: 18,7 %; haploid: 9,2 %)
e. In Embryonen der Gruppe mit gesextem Sperma wiesen 90,9 % der Embryonen an Tag sieben das Stadium der Morula auf, wovon sich nur 7,1 % bis zum nächsten Tag weiter zur Blastozyste entwickelten
5. Sexing
Die Embryonen der CA-Gruppen, die der X-chromosomal-gesexten Gruppe und die der Sham-Gruppe mit diploider Aktivierung zeigten mit 100 % weiblichen Embryonen das erwartete Geschlechtsverhältnis. Ebenso erfüllten die Embryonen der IVF-Gruppen mit 33,3 % Anteil an weiblichen Embryonen bei den Morulae und 67,9 % bei den Blastozysten die Erwartungen zur Geschlechtsverteilung. Für Stadien der ICSI-Gruppe mit diploider Aktivierung wurde zumindest ein Teil an männlichen Embryonen erwartet, dieser lag jedoch bei 0 %. Für die der haploid aktivierten Gruppe wurde eine ca. 50:50 Aufteilung erwartet, der Anteil weiblicher Embryonen lag jedoch bei 93,3 %. Für beide ICSI-Entwicklungsstadien (mit Y-chromosomal gesextem Sperma erstellt) wurde eine 100 % männliche Verteilung erwartet. Sie lag jedoch bei den Blastozysten bei 100 % und bei den Morulae bei 63,6 % weiblichen Embryonen
6. Transkripte:
a. DNMT1: Eine signifikant erhöhte Transkriptmenge wurde in den Embryonen der diploid aktivierten ICSI-Gruppe und der IVF-Gruppe gegenüber den Embryonen der diploiden CA-Gruppe und der haploid aktivierten Gruppe festgestellt.
b. DNMT3a: In den Embryonen der diploid aktivierten ICSI-Gruppe lagen signifikant erhöhte Transkriptmengen gegenüber allen anderen Embryonen aller Gruppen vor. Ebenso wurde eine Erhöhung bei den Blastozysten der IVF-Gruppe gegenüber der bei den Morulae in der IVF-Gruppe und der ICSI-Gruppe mit Y-chromosomal gesextem Sperma detektiert.
c. IGF2R: Es lag eine signifikant erhöhte Transkriptmenge in den Blastozysten der diploid aktivierten ICSI-Gruppe gegenüber denen der haploid aktvierten Morula der ICSI-Gruppe mit Y-chromosomal gesextem Sperma vor. Ebenso wiesen die Stadien der IVF-Gruppe bei den Blastozysten eine signifikant erhöhte Transkriptmenge gegenüber den Morulae aus der Y-chromosomal gesexten ICSI-Gruppe auf.
d. NNAT: Es konnte eine tendenziell höhere Transkriptmenge für die Blastozysten der IVF-Gruppe gegenüber den Embryonen aller anderen Gruppen ermittelt werden. Ebenso war die Transkriptmenge in den weiblichen Blastozysten der IVF-Gruppe gegenüber denen der Morula signifikant erhöht.
e. G6PD: Die Transkriptmenge der Embryonen der ICSI-Gruppe mit diploider Aktivierung war signifikant gegenüber denen aller anderen Gruppen erhöht, ausgenommen bei der IVF-Gruppe mit weiblichen Blastozysten. Ebenso war ein signifikanter Unterschied zwischen den weiblichen und männlichen Blastozysten der ICSI-Gruppe und den männlichen Morulae der ICSI-Gruppe zu erkennen.
f. BCL2L1: Die Embryonen der diploiden ICSI-Gruppe wies eine signifikant höhere Transkriptmenge als die der beiden CA-Gruppen und die der Gruppe der Morula aus der Gruppe mit Y-chromosomal gesextem Sperma auf. Die Transkriptmenge der Blastozysten der IVF-Gruppe war signifikant gegenüber der der weiblichen Morulae der ICSI-Gruppe mit Y-chromosomal-gesextem Sperma erhöht.
g. BAX: Die relative Transkriptmenge der Embryonen in der ICSI-Gruppe mit diploider Aktivierung war signifikant gegenüber denen der weiblichen Morula der ICSI-Gruppe mit Y-chromosomal-gesextem Sperma erhöht. Ebenso wiesen die Blastozysten der IVF-Gruppe signifikant höhere Werte als die Morulae der ICSI-Gruppe auf.

Abschließend kann zusammengefasst werden, dass das Sexing der ICSI-Gruppe mit Y-chromosomal gesextem Sperma konkrete Rückschlüsse auf den Anteil parthenogenetischer Embryonen zulässt. Dieser Anteil ist sowohl im Morulae- als auch Blastozystenstadium sehr hoch. Die anderen Nachweisverfahren und Gruppen lassen nur Tendenzen für einen hohen Anteil parthenogenetischer Embryonen erkennen. Weitere geeignete Methoden müssen erforscht und etabliert werden um eindeutige Aussagen für ICSI-Gruppen nach Verwendung ungesextem Spermas zu erlangen. Der Anteil tatsächlich befruchteter Stadien scheint somit niedrig zu sein. Um die ICSI als konventionelles Verfahren der IVP zu etablieren ist es somit von großer Bedeutung im ersten Schritt parthenogenetische Stadien zu erfassen und nur tatsächlich befruchtete Stadien zu übertragen. Daran anschließend muss es zu einer Verbesserung der Aktivierungsverfahren hin zu einem höheren Anteil tatsächlich befruchteter Stadien kommen. Zum einen wäre es sinnvoll Aktivierungsprotokolle zu verwenden, die zu einem hohen Anteil eine haploide Aktivierung der Eizelle verursachen. Durch den Einsatz einer Vorbehandlung der Spermien und einem geeigneten Aktivierungsprotokoll nach der ICSI wäre zudem eine bessere paternale Vorkernausbildung möglich.